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支原体祛除剂加强型MynoxGold(保种用)步骤详解

DIANJICISHU:51   FABUSHIJIAN:2019/12/27 15:47:04

Mynox® Gold含*惟一的支原体杀除剂(而非抑制剂)Mynox®以及复合抗生素,用于祛除污染珍贵细胞或病毒种子批中的支原体和保种用。


一个疗程它由1管首次治疗液和3管主治疗液(),每管均为520μl即用型无菌溶液,2℃~8℃避光保存。首次治疗液可以杀灭大部分支原体,对细胞没有毒害,主治疗液杀灭所有剩余的支原体,实现彻底根除。

其操作示意图如下:


 

 

实验所需耗材:25cm2
细胞培养瓶或60 mm 培养皿

支原体消除结果评估:采用支原体检测试剂盒如Venor® GeM系列。

 

具体操作步骤如下(超净台内操作):


1. 制备“首次治疗混合液”

1)吸量管吸取4.5ml含5%胎牛血清的细胞培养基,加入到无菌的15ml离心管中。再加入500 µl Mynox ®   Gold首次治疗液(橘黄色盖)。

2)将15ml离心管内的培养基和Mynox® Gold首次治疗液混匀。

3)将15ml离心管内的混合液(5ml)转移至无菌的25cm2细胞培养瓶或60 mm 培养皿中。

 

2. 加入细胞

按细胞正常传代来操作。对于贴壁细胞,使用胰酶将细胞解离打散。

1)注意:显微镜下观察,确保为单细胞悬液,无细胞成团。

2)吸量管吸取5ml单细胞悬液(含104–105细胞,细胞培养基含5%胎牛血清),加入到上述的“首次治疗混合液”中。此时总体积为10ml。

注意:加入细胞时,吸头插入到液面下,以避免产生气溶胶。吸头不要触及培养瓶/皿的内壁。

3)轻轻摇晃培养瓶/皿,以避免细胞分布不均。将细胞转至孵箱正常培养。

 

3. 主要治疗

1)细胞长至80~90%汇合。

2)细胞正常传代。取9.5ml已加新鲜培养基的细胞,加到无菌培养瓶或培养皿中。再加入500 µl Mynox® Gold主治疗液(透明管盖)。调整胎牛血清浓度,请勿再加至5%。应低于该浓度。

3)加入主治疗液的细胞继续培养,再重复以上步骤2次(采用Mynox® Gold主治疗液 治疗2次)。

  第3次主治疗液治疗后,支原体即完全去除(细胞总共传了4代)

 

4. 支原体残留的检测

注意:支原体被Mynox®裂解后会释放DNA到培养基中,此时检测支原体会导致假阳性。应再正常培养四代后检测支原体。培养基更换和使用外源DNA酶可在1-2代内降低游离的支原体DNA。

 

建议采用高灵敏度的Venor ® GeM支原体检测试剂盒检查支原体。

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